中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识

近日，“中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识”在《中华神经科杂志》发布。

该共识由中华医学会神经病学分会感染性疾病与脑脊液细胞学学组组织撰写，西北大学医学院赵钢教授，首都医科大学附属北京同仁医院王佳伟教授，中国医学科学院北京协和医院关鸿志教授为通信作者，从mNGS应用概况，临床适应证和送检时机，标本的管理、检测、报告及实验室质控，报告的临床解读等方面提出了规范化意见。

本次共识的发布，对于mNGS在中枢神经系统感染中的应用指导意义重大，将进一步推进更加规范合理地应用mNGS技术，助力临床CNS精准诊疗。

一

mNGS的应用概况

2014年，国际上开始报告使用mNGS诊断神经感染病例^[1]。2015年以来，脑脊液 mNGS在国内逐渐应用于神经系统感染性疾病的诊断^[2]。此后，国内外开展了一系列队列研究^[5‑9]，报告脑脊液mNGS检出致病病原体的比例为15.7%~ 57.0%；在神经感染病例中，mNGS与传统病原学技术同时阳性的比例为22.5%~52.6%；此外，一项非前瞻性研究结果显示，脑脊液mNGS在脑炎与脑膜炎诊断中的敏感度为73%，特异度为 99%^[10]；充分说明了脑脊液mNGS 对CNS感染性疾病病原诊断的实用性。我国在使用 mNGS 诊断神经感染的技术进展上与世界同步^[11]。

二

临床适应证和送检时机

（一）脑脊液mNGS适应证

脑脊液 mNGS 主要适用于怀疑CNS感染性疾病患者的致病性病原体鉴定，包括病因未明的脑炎、脑膜炎(包括脑炎与脑膜炎叠加的脑膜脑炎)和脑脓肿等疾病的患者。

（二）脑脊液mNGS送检时机

1

对于社区获得性急性脑炎和脑膜炎，非重症患者一般可以先开展脑脊液传统微生物学检查，仍不能明确病因时再送检脑脊液 mNGS；必要时在首次留取脑脊液时预先将 2~5ml 脑脊液标本保存于-20℃冰箱，若经过脑脊液传统微生物学检查在3d内未获得明确的病原学证据且经验性抗感染治疗无效，建议对预留的脑脊液标本进行mNGS检测。

对重症患者建议首次脑脊液检查即送检mNGS；对于高度怀疑新发病原体^[12‑13]、罕见病原体感染，而临床缺乏其他可及的检测方法时，建议首次脑脊液检查即送检脑脊液mNGS。

对于医院获得性急性脑炎和脑膜炎，若经过包括脑脊液传统微生物学检查在内的系统性检查（影像学检查、实验室检查）仍未能明确病因，且患者接受经验性治疗后无显著好转，建议复查脑脊液，并送检mNGS。

2

对于病因不明的慢性CNS感染性疾病患者，例如病因未明的慢性脑膜炎患者，首选脑脊液mNGS进行检测^[14‑15]。

3

对于原发性免疫缺陷、粒细胞缺乏、艾滋病、服用免疫抑制剂等免疫功能缺陷的患者，由于病情复杂、进展快、潜在的病原体种类繁多、存在新发病原体可能，建议首次脑脊液检查即送检mNGS^[16‑17]。

4

临床怀疑CNS感染患者的标本一般送检病原微生物DNA检测；若临床高度怀疑RNA病毒感染，例如不明原因的基底节脑炎，则需要加送病原微生物RNA检测，但RNA病毒的脑脊液 mNGS 阳性率较低^[14]。

推荐意见

对于病因不明、经验治疗效果不佳、重症、免疫缺陷（抑制）的脑炎、脑膜炎和脑脓肿患者，建议送检脑脊液mNGS。

三

标本的管理、检测、报告及实验室质控

标本的质量直接影响检测结果及其同临床诊断的符合度，是mNGS病原学诊断的关键因素。标本管理相关的标准操作程序和标本采集手册应该由实验室工作人员和临床医生共同讨论确定。

（一）标本类型

本共识主要基于脑脊液标本。在脑脊液标本检测结果不能辅助诊断或者不能获得脑脊液标本，但是又高度怀疑CNS感染时，建议采集脑组织活组织检查（活检）标本或者血液标本送检，具体送检流程可以咨询检测机构。

（二）标本信息

送检标本应有送检申请表，填写受检者信息，包括标本唯一性编码、采样日期、采样时间、患者个人基本信息、标本组织类型、采样单位和临床资料等。收集标本的容器上应注明患者的唯一信息，通常可包括检测编码、受检者的姓名、送检科室和住院号等信息。医护人员在采样前需仔细核对患者信息。

（三）知情同意

标本采集前主管医生应向患者或其监护人或者委托人告知所检测项目的目的、总体阳性率、优点和局限性（有限的特异度与敏感度，可能出现假阳性或假阴性结果）、费用（包括是否为自费）、预期报告时间、剩余标本的去向及保存时间、临检标本是否可匿名用于科研项目等，并告知mNGS以外的其他可选检验项目，以获得知情同意。在整个流程中，要注意保护患方的个人隐私。

（四）标本采集

脑脊液标本采集可以按照临床腰椎穿刺常规操作方法。为减少标本采集时的微生物污染，应使用严格的无菌技术，采集脑脊液时要充分消毒穿刺点及周围皮肤^[18]。尽量避免脑脊液标本中混入血液。建议送检第2管或者第2管之后的标本，送检量2~5ml，送检前尽量减少对标本的额外分装^[18]。

（五）标本保存和运输

标本保存管应无菌、无消毒剂及防腐剂、无污染、密封性好、材质透明以便于观察。标本采集后需要采用冷链运输；采集后4h内开始检测的标本在2~8 ℃保存和运输；间隔时间长于4h短于1周的标本在-20℃以下保存，干冰运输；间隔时间长于1周的标本建议低于-70℃保存；标本应避免反复冻融，运输时避免剧烈震动^[18‑19]。标本采集后应及时送检，转运标本时，应按照国家有关生物安全标准标识、包装标本，运送过程符合生物安全规范的要求，严防外部微生物污染标本，同时要防止标本内容物泄漏污染环境。

推荐意见

用于脑脊液mNGS的脑脊液标本需要无菌获取，冷链运输，避免污染。

（六）检测与报告

1

脑脊液 mNGS检测过程包括标本处理、核酸提取、文库制备、上机测序、数据处理、序列比对、人源序列去除、微生物注释和报告^[3]。整个检测体系应该有完整的质量控制方案和参数，用于比对和注释的病原微生物数据库应该尽量完整、精确并定期更新，并需要对检测流程的分析性能进行确认，以保证检测报告的准确性^{[10，20‑22]}。

2

mNGS 病原检测报告需要符合《医疗机构临床实验室管理办法(卫医发〔2006〕73号)》和《医学检验实验室基本标准和管理规范(试行)国卫医发〔2016〕37号》对检测报告的要求，列出患者信息、标本信息、检测方法、检测范围、结果、检测机构与报告人信息等内容。检测报告需要有严格的发放和审核流程，以确保报告的及时、有效、正确和完整。

3

报告应该列出微生物的特异性序列数，在此基础上建议列出基因组覆盖度、相对丰度等指标，或者列出综合多种指标的参数并加以解释（例如置信度）。特异性序列是指唯一匹配到某种微生物基因组的核苷酸序列，其检出数量会受到微生物基因组大小、测序策略、标本中微生物载量及其核酸提取难易程度、标本中人源核酸比例等因素的影响。

4

报告的微生物应该是符合阳性判断标准(即高于报告阈值)的微生物，具体的阳性判断标准难以统一，可以在确定测序平台、检测流程、数据库和生物信息分析方法后进行设置。

（七）实验室质控

mNGS 检测主要包括实验操作与生物信息学分析两部分。实验室应建立室内标准作业程序(standard operating procedure）及质量管理体系，并定期参加室间质评与能力验证，并有持续的质量保证和改进计划^[23‑24]。

四

报告的临床解读

临床需要综合流行病学史、临床表现、影像学、脑脊液学与血清学等检查结果，对脑脊液mNGS检测报告进行解读，尽量充分利用传统的微生物鉴定方法验证mNGS结果。阳性结果解读需要关注：微生物是否具有人类神经系统侵袭性(嗜神经性)的生物学特征，患者临床表现是否和微生物的致病特性一致，报告微生物是否和其他病原学检查结果一致。

（一）阳性结果的解读

1

报告的微生物具有神经侵袭性，且与临床经验诊断相一致，可初步确定其为责任病原体；脑脊液 mNGS 检测到肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、单纯疱疹病毒(HSV)1型、HSV2型、水痘‑带状疱疹病毒等病原体时多属于这种情况^[2，25]。

2

报告的微生物和传统微生物检查结果一致，表明其在样本中存在，报告微生物是责任病原体的可能性很大。

3

当脑脊液中检出非人体定植菌且环境中不常见的微生物(例如单核细胞增生性李斯特菌^[26]、猪带绦虫^[27‑29]、广州管圆线虫^[30‑32]、阿米巴^[33‑34]等)时，有可能是责任病原体，因此阳性报告就应该考虑其致病可能。

4

某些微生物(例如结核分枝杆菌、诺卡菌、某些真菌)的生长特点和结构特点导致其核酸提取的难度较大，检出的特异性序列数可能少，因此，阳性报告就应该考虑其致病可能^[35‑40]；例如，结核分枝杆菌的特异性序列数可以低至1个^[37]，隐球菌的特异性序列数可以低至1~2个^[35，38]，白色念珠菌的特异性序列数可以低至6个^[7]、单核细胞增生性李斯特菌可以低至8个^[41]，诺卡菌可以低至12个^[36]。

5

部分DNA病毒可在CNS潜伏，阳性结果需要综合临床病情来判断其是潜伏感染、病毒携带状态还是活动性感染。例如：脑脊液EB病毒核酸阳性，可以见于潜伏感染、活动性感染、EB病毒相关淋巴细胞增殖性疾病以及EB病毒感染相关神经免疫性病^[42‑45]。

6

mNGS检测出阳性微生物但是传统微生物检查结果阴性时，需要根据检出微生物致病特性，结合临床综合评估其致病可能。

7

报告微生物有可能来源于环境污染或者腰椎穿刺点附近皮肤定植，不同的患者和就诊场所其微生物种类不同，临床医生可以和检测机构沟通确定各自的背景微生物，但是，在人体免疫功能受损时，某些定植微生物也可能是致病菌。

8

若同一患者的同类标本多次送检，在检测条件一致的情况下，同一种微生物序列数的变化可以辅助判断疗效^[31，44]。

9

对于免疫功能缺陷的患者，易发生CNS机会性感染(JC病毒、CMV、隐球菌、弓形虫等)^[46‑48]，且临床表现不典型，要高度重视报告微生物的致病可能。

（二）阴性结果的解读

阴性结果表明所有检测到的微生物都不符合阳性判断标准，如果临床医生经过综合评估，对结果存疑时，可以参考低于检测阈值的微生物。

1

脑脊液mNGS阴性结果不能完全排除CNS感染性疾病；当脑脊液 mNGS检测结果为阴性时，首先排除因标本采集、运输和保存不当而造成的假阴性，如果临床仍怀疑CNS感染性疾病，可复查传统病原学检测，或者扩大病原体鉴别诊断的范围，尤其是对mNGS检测相对不敏感的病原体（如结核分枝杆菌和乙型脑炎病毒等），必要时再次送检mNGS，可考虑送检独立第三方检测机构。

2

脑脊液微生物DNA检测结果为阴性时需要考虑RNA病毒感染的可能，例如流行性乙型脑炎和新型布尼亚病毒脑炎等，建议送检脑脊液微生物RNA检测，并送检RNA病毒相关的抗体检测和PCR检测。

3

脑脊液mNGS结果为阴性时，临床应关注非感染性病因的可能性，包括自身免疫性脑炎、肿瘤、CNS血管性疾病等，进一步完成相关检查与鉴别诊断。

4

若患者近期内曾有mNGS检测阳性结果，在综合临床病情的基础上，同种标本相同病原体的复检阴性结果可能提示临床治疗有效^[7,40,49]。

（三）脑脊液mNGS检测后的临床应对措施

1

对于确定的责任病原体，则展开针对性的目标治疗，如果已有经验性抗感染治疗用药，责任病原体和预期判断不同的则更换药物或者停药，和预期判断一致的则可以继续相关治疗或降阶梯治疗；后续治疗如果效果差，需要考虑病原体耐药、基础疾病、药物剂量等原因。

2

临床怀疑mNGS为假阳性结果时，则需要根据不同病原体鉴定的具体方法，选用一代测序、抗体或者抗原血清学检测、培养、脑脊液细胞学和脑活检病原体染色等技术，进行进一步验证；对于检出的罕见微生物，需要查阅文献，从各方面综合判断证实其致病性；仍不能验证或者排除的，可以进行诊断性治疗。

3

对于mNGS首次在人体标本中检测到的动物源性微生物，要高度重视其作为人类新发CNS感染性疾病病原体的可能，综合临床流行病学调查、临床表现、病原学验证(核酸检测、抗原抗体检测、病理学检查、病原分离培养、动物接种等)等结果来判断，必要时需要上报疾病预防控制中心等管理部门。

4

如果mNGS检测结果阴性，但检测之前的经验性抗感染治疗有效，则不能因为mNGS阴性结果而终止有效的经验性抗感染治疗。

5

对于mNGS检测结果和临床表现不符合的患者，需要评估患者的免疫功能是否受损，送检外周血淋巴细胞亚群和免疫球蛋白等，协助判断是否是致病微生物。

推荐意见

脑脊液mNGS检测到具有神经侵袭性病原体，如果与患者临床表现高度符合则可以被认为是确定的责任病原；脑脊液 mNGS 结果阴性时，临床应关注非感染性病因的可能性，完善相关检查与鉴别诊断。

总结

经过不断的技术优化、临床应用研究与经验积累，脑脊液mNGS已经成为CNS感染病原学鉴定的重要实用技术^[50]。我们希望本共识能够帮助临床医生更合理、更规范地应用脑脊液mNGS并解读检测结果，提升mNGS在CNS感染中应用的精准性^[20]。针对不同的患者和标本特点采用不同的检测流程并标准化，根据不同医院的微生物分布特点实施不同的分析策略，可能是未来CNS感染精准病原学检测的方向，学组也将持续开展脑脊液mNGS研究，总结研究成果，跟进国内外研究进展，适时更新共识。

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来源：微岩医学 | 供稿：Weber

编辑：弋水 | 校对：Miley | 责编：木霖森

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